作者单位：青岛大学附属医院口腔颌面外科(黄岛院区),山东青岛() E- 哺乳动物腭的形成过程包含众多环节，包括腭突上皮与间充质之间的相互作用，两侧腭突的接触、粘着与融合等。该过程受到多种细胞因子、信号分子及信号通路的调控。在胚胎发育的早期，任何外源性致畸因子都可能通过改变细胞因子的表达，影响腭突的正常发育，从而导致腭裂的发生[1-2]。在唇腭裂胚胎形成期基因表达具有时空特异性，明确基因表达的时空特异性有助于厘清唇腭裂发生的病理机制。已经有实验证实许多因子如转化生长因子β(transforming?grouth?factor-β,TGF-β)[3]、骨形态发生蛋白(bone?morphogenetic?protein,?BMP)[4]等在胚胎腭突发育过程中具有时空变化特征，被认为是重要的唇腭裂发生的候选基因。血小板衍化生长因子(platelet?derived?growth?factors，PDGF)信号通路是参与调节颅面发育的许多信号通路其中之一。PDGFR包括两种酪氨酸激酶受体?PDGFR-α和PDGFR-β。PDGFR-α能够调节细胞迁移、增殖和分裂[5]。有学者发现在斑马鱼动物模型上，PDGFR-α突变，将导致包括唇腭裂在内的颅颌面畸形的发生[6]。Eberhart等[7]进行的流行病学研究认为小RNA140通过负调控PDGFR-α蛋白表达水平，影响腭的形成。Rattanasopha等[8]对102名先天性腭裂患者进行PDGFR-α整个编码区和3?端非翻译区进行PCR测序，其中9例患者被发现有7个异常的碱基对出现，发生率为8.8%，与正常人群的1%突变率相比，差异具有统计学意义。综上，PDGFR-α可能与腭裂的发生有关。 腭的发育过程中PDGFR-α在组织中的时空表达变化情况尚不清楚。本实验研究了C57BL/6J小鼠胚胎腭突在融合过程中PDGFR-α蛋白的时空表达情况，为后续进行PDGFR-α基因参与影响腭突融合的信号转导通路研究打下基础。 1.1　?研究对象 本实验采用SPF级8～10周C57BL/6J近交系小鼠作为研究对象，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司。 1.2　?主要仪器、试剂和耗材 石蜡轮转切片机(RM2235)(德国徕卡)、组织包埋机(EG1150)(德国徕卡)、普通光学显微镜(Leica?)(德国徕卡)；高压消毒蒸锅、-80?℃低温冰箱(日本SANYO公司)、倒置相差显微镜(SZ61TRC-LIST)(日本Olympus公司)；凝胶成像分析仪(美国Kodak公司)；Rayto?2100?C酶标仪(中国上海研域仪器设备有限公司)。兔抗小鼠PDGFR-α单克隆抗体(美国Adcam公司)；小鼠抗人β-actin、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、SP?kit免疫组化试剂盒(中国北京中山金桥生物技术有限公司)；5×蛋白Loading?Buffer、DAB染色试剂盒(中国武汉博士德公司)；Enhanced?Western?HRP?Substrate(发光液)(意大利Cyanagen公司)；BCA法蛋白浓度测定试剂盒(中国北京碧云天生物技术公司)；PVDF膜(美国millipore公司)。 1.3　?实验方法 1.3.1　胎头取材和标本处理　根据之前的方法[9]分次取得妊娠13.5?d(简写为GD?13.5)、GD?14.5、GD?15.0、GD?15.5时C57BL/6J小鼠胎头。将小鼠胎头于新鲜配置的4%中性多聚甲醛中固定5?h。随后乙醇梯度脱水，浸蜡，头部喙部朝下常规石蜡包埋。 1.3.2　免疫组织化学方法检测　PDGFR-α在小鼠胚胎腭突不同发育时期中的表达实验之前使用0.01%多聚赖氨酸(Poly-D-lysine，PDL)对进行免疫组织化学染色的切片行预处理。各切片行二甲苯液处理3次；无水乙醇梯度脱水；EDTA抗原修复液进行高压修复；3%过氧化氢孵育,封闭内源性过氧化物酶；滴加一抗后在37?℃恒温水浴箱里孵育1?h；滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体(二抗)；PBS洗涤4次，各组织切片上滴加新鲜配制的DAB溶液，显色2?min；苏木素染色2?s：细胞核着色。再次乙醇梯度脱水后，镜下观察阳性结果，统计阳性指标：以各个不同发育时期腭突细胞胞浆中出现黄色颗粒为阳性细胞。 1.3.3　Western?blot方法检测　PDGFR-α和SHH蛋白在小鼠胚胎腭突不同发育时期中的表达变化首先将腭突组织称重，按照每1.0?mg中加入1.0?mL的裂解液的比例，分别加入裂解液进行研磨，提取蛋白。根据BCA蛋白浓度试剂盒说明操作、用酶标仪550?nm?测定吸光值，计算蛋白浓度。然后SDS-PAGE电泳，半干法转膜。将转膜后的PVDF膜放入TBST配制的5%?脱脂奶粉中，室温封闭2?h。封闭后的PVDF膜孵育一抗，室温2.5?h后4?℃过夜。TBST洗膜，将膜与二抗作用，室温孵育1?h，TBST洗膜3次，每次10?min。显色：将发光液按100?μL/cm2?的比例加到膜上，室温反应1?min，将膜置于成像系统中显色并拍照。Image?J图像分析软件对每个样品目的条带的灰度值进行测定，并与其相对应的内参GAPDH条带的灰度值做比值，每个样品目的条带分别检测3次，取其平均值，将所得到的数据使用三线表进行描绘。 1.4　统计学方法 实验结果应用SPSS?19.0统计软，进行正态性检验和方差齐性检验，用单因素ANOVA进行总体检验和LSD进行两组间检验，所有实验均至少重复3次，P<0.05表示差异有统计学意义。 2.1　?PDGFR-α蛋白在小鼠胚胎腭突不同发育时期中的表达 依次选取形态良好、结构完整的GD?13.5、GD?14.5、GD?15.0、GD?15.5小鼠胚胎腭突组织切片，经烤片、0.01%多聚赖氨酸预处理后，常规行免疫组织化学染色。结果如下。 2.1.1　GD13.5时小鼠胚胎腭突中的表达　PDGFR-α在垂直向生长的腭突中有较明显表达。腭突间充质中的表达部位主要集中在腭突中外侧，表达量自靠近腭突口腔侧上皮处向鼻腔侧上皮处移行过程中渐减弱，在靠近鼻腔上皮处的间充质中未见明显表达，在腭突尖部间充质中表达量较少；腭突上皮组织中未见明显表达。鼻中隔上皮及间充质中可见有较为强烈表达。舌及口底上皮亦未见明显表达，舌体及口底间充质中有表达明显(图1A)。 2.1.2　GD14.5时小鼠胚胎腭突中的表达　PDGFR-α弥散、强烈表达在整个水平向生长的腭突组织中。腭突间充质中的表达部位均匀分布在整个腭突，与外侧的上颌突间充质中表达量对比明显；腭突口、鼻侧及中嵴上皮中都有强烈表达。鼻中隔上皮和间充质中亦表现出弥散、强烈表达。舌体及口底区上皮和间充质中同样表达明显(图1B)。 2.1.3　GD15.0时小鼠胚胎腭突中的表达　PDGFR-α在腭突上皮及间充质中的表达明显变弱。间充质中的表达部位主要集中在腭中嵴上皮缝两侧区域，在靠近腭突口腔侧上皮的间充质中亦有少量表达；上皮中的表达部位主要集中在腭突鼻腔侧及双侧腭突黏附后在口鼻侧形成的“上皮三角”区域，腭突口腔侧上皮未见明显表达。鼻中隔上皮及间充质中有较明显表达。舌上皮中未见明显表达，舌间充质及口底区域中表达明显(图1C)。 2.1.4　GD15.5时小鼠胚胎腭突中的表达　PDGFR-α在腭突中的表达较前期阶段再次变弱。腭突间充质中的表达部位主要集中在腭正中间位置，表达较轻微；腭突鼻腔侧上皮中有轻微表达，而口腔侧上皮中未见明显意义表达。舌上皮未见明显表达，舌体间充质和口底区域表达明显(图1D)。 PS：腭突；?N：鼻；L：舌肌；P：腭PS：?palatal?shelf;?N:?nose;?L:?lingualis;?P:?palateA：GD13.5时PDGFR-α的表达；B：?GD14.5时PDGFR-α的表达；C：?GD15.0时PDGFR-α的表达；D：?GD15.5时PDGFR-α的表达A：?The?expression?of?PDGFR-α?in?GD13.5;B：?The?expression?of?PDGFR-α?in?GD14.5;?C：?The?expression?of?PDGFR-α?in?GD15.0;D：?The?expression?of?PDGFR-α?in?GD15.5图1　免疫组化染色显示PDGFR-α在小鼠胚胎腭突中的表达(　×40)Fig.1　Immunohischemical?staining?of?PDGFR-α?in?the?palatal?shelf?of?mouse?embryo(　×40) 2.2　PDGFR-α在小鼠胚胎腭突不同发育时期的蛋白表达变化 如图2所示：PDGFR-α在小鼠胚胎腭突不同发育时期的蛋白表达变化和免疫组化染色结果基本相一致，GD13.5时PDGFR-α蛋白的表达为1.；GD14.5时PDGFR-α蛋白的表达达到最高峰(1.),随后，GD15.0及GD15.5时PDGFR-α蛋白表达逐渐下接隚D13.5比较，P=0.045；GD14.5与GD15.0比较，P=0.030；GD14.5与GD15.5比较，P=0.027。以上差异均有统计学意义。 图2　WB检测不同胚胎腭突发育时期中的PDGFR-α蛋白表达量Fig.2　The?expression?of?PDGFR-α?during?different?embryo?development?stages?by?Western?blot?analysis 血小板衍化生长因子(platelet?derived?growth?factors，PDGF)是由血小板释放到整个血清当中的，能够刺激多种间充质细胞[10]和神经胶质细胞[11]增殖。PDGF家族包括4个配体-PDGF-A、-B、-C、-D和两个酪氨酸激酶受体-PDGFRα和?PDGFRβ[12]。PDGF的促有丝分裂作用的发挥需要与血小板衍生生长因子受体(PDGFR)相结合[13]。 最早认为PDGFR-α与人类膈肌疝的发生相关[14]，其在间充质细胞迁移和增殖过程中起重要作用[15]。PDGFR-α体内表达广泛，因此，它的编码区域发生突变将可能导致一系列组织器官的发育异常，然而miR-140缺失引起的发育异常仅仅表达在腭部[16]，研究发现PDGFR-α非编码区3?端发生突变将增加与miR-140的亲和力，导致PDGFR-αmRNA减少。因此，Rattanasopha等[8]第一次提出了PDGFR-α在腭突发育中起作用的观点。 PDGFR-α信号转导通路与炎症的发生、胚胎的形成等密切相关。有研究称PDGF信号通路与人类先天性唇腭裂的发生相关，正如在小鼠体内的情况一样，缺乏PDGFC的表达将导致唇腭裂的发生[17]。有证据显示：转录因子维甲酸调控了唇腭裂的发生时PDGFC的表达，外源性的添加维甲酸或者PDGFC沉默的抗体，导致鳃弓衍生出腭突出现障碍，值得注意的是，同样减少了PDGFR-α的表达[18]。最近的一项研究证实，在斑马鱼动物模型上，PDGFR-α突变合并添加miR-140的斑马鱼胚胎出现包括腭裂在内的一系列先天发育畸形[7]。研究表明位于前miR-140的单核苷酸多态性区域通过影响PDGFR-α中miR-140的加工过程而导致腭裂的发生[19]。而有研究对102名先天性腭裂患者进行PDGFR-α整个编码区和3?端非翻译区进行PCR测序发现，其中9名患者被发现了共有7个异常的碱基对出现，发生率为8.8%，与正常人群的1%突变率相比，差异具有统计学意义(P<0.01)[8]。 在既往的研究当中，Eberhart等提到PDGFR-α在斑马鱼腭突间充质中表达。迄今PDGFR-α在胚胎腭突发育过程中的时空表达变化的系统研究还未见报道。在本实验中我们应用小鼠这种哺乳动物通过免疫组织化学方法检测到在腭突不同的发育时期PDGFR-α特异性表达：PDGFR-α在小鼠胚胎腭突不同发育时期的表达呈现出连续、动态变化的趋势。在GD13.5时PDGFR-α主要在小鼠腭突间充质中表达，表达量较少；在GD14.5时PDGFR-α在腭突中的上皮和间充质中都有表达，且表达很强烈，较GD13.5时明显增强；在GD15.0时，PDGFR-α主要在间充质中的腭中嵴上皮缝两侧区域及上皮当中的腭突鼻腔侧及双侧腭突黏附后在口鼻侧形成的“上皮三角”区域有表达，且表达量较GD14.5明显减少；在GD15.0时PDGFR-α主要在正中区域腭突间充质和鼻腔侧上皮中有轻微表达，表达量较GD15.0再次减少。同时通过Western?blot的方法检测了在腭突不同发育时期PDGFR-α的蛋白表达量，PDGFR-α在腭突水平向即将融合时的GD14.5的表达与其它时期相比显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。 总之，我们的研究发现在腭突发育过程中PDGFR-α存在时空表达变化。提示了PDGFR-α在小鼠腭突发育过程中可能发挥调节作用，提示了PDGFR-α可能是一个重要的先天性腭裂发生候选基因。本实验为后续PDGFR-α基因参与影响腭突融合的信号转导通路的研究打下基础。

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